ELISA免疫標記技術實驗原理
【摘要】：免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統中抗原或抗體的性質與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為3大免疫標記技術。
相關專題ELISA免疫實驗技術
免疫標記技術是將一些既易測定又具有高度敏感性的物質標記到特異性抗原或抗體分子上，通過這些標記物的增強放大效應來顯示反應系統中抗原或抗體的性質與含量。常用的標記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標記物進行標記的免疫檢測技術被稱為3大免疫標記技術。目前，使用的免疫標記物還有化學發光物質、鐵蛋白和膠體金等。
1.原理
辣根過氧化物酶(HorserADIsh Peroxidase, HRP)
辣根過氧化物酶 (horse radish peroxidase，簡稱HRP，EC.1.11.1.7)是植物中研究得zui深入的一種過氧化物酶，早在20世紀30年代就有人著手從辣根中分離此酶，以后又制備出結晶。本實驗是以辣根為原料，經過水的抽提，硫酸銨和丙酮分級分離，再經鋅離子純化，透析除鹽，冰凍干燥，便可得到高純度的辣根過氧化物酶。
辣根過氧化物酶是一種含亞鐵血紅素的蛋白質，HRP廣泛分布于植物界，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，Mr在40000左右，等電點7.2。溶于水，溶解度為5%(W/V)，溶液呈棕紅色，透明。酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58%以下的硫酸銨溶液。HRP可溶于0.58飽和度以下的硫酸銨溶液，而0.62飽和度以上則不溶。該酶zui適pH7.0(對愈創木酚為氫給體而言)。在室溫下，HRP幾周內穩定，加熱到63℃，在15min內穩定。氧化還原電勢很低，pH6.08時，E 0 =-0.2070V，pH為7.71時，E′0 =-0.2787V。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm/OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。* ?# p. n2 ~1 w. X3 b
酶標記物包括酶標記抗原、酶標記抗體和酶標記SPA等。酶標記物質量的好壞直接關系到免疫酶技術的成功與否，因此被稱為關鍵的試劑。酶標記物中zui常用的是酶標記抗體，它是將酶與特異性抗體經適當方法連接而成。酶標記抗體的質量主要取決于純度好、活性強及親和力高的酶和抗體，其次要有良好的制備方法。目前，高質量的酶(如辣根過氧化物酶，簡稱HRP)國內已有商品供應。高質量的抗體則可通過提取純化而獲得。在制備方法上，宜選用產率高、不影響結合物的活性和不混雜干擾性物質且操作簡便易行的方法。
酶制劑及其底物
凡無毒性又能呈現有色化學反應的酶，原則上均可作為標記用。但作為標記抗體用的酶應滿足下列要求：
(1)來源方便，易于純化;
(2)比活性高，性質穩定;
(3)酶活性和量能
用簡單方法測定。目前在免疫酶技術中常用的酶為辣根過氧化物酶(HRP)和鹼性磷酸酶(AP)，其次還有葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶、溶菌酶和蘋果酸脫氫酶等。
由于辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)比活性高，穩定，分子量小，純酶容易制備，所以zui常用。HRP廣泛分布于植物界，辣根中含量高，它是由無色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結合而成的糖蛋白，糖含量18%。HRP由多個同功酶組成，分子量為40,000,等電點為PH3～9,酶催化的zui適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在PH5左右。酶溶于水和58%以下飽和度硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白zui大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以OD403nm /OD275nm的比值RZ(德文Reinheit Zahl)表示酶的純度。高純度的酶RZ值應在3.0左右(zui高可達3.4)。RZ值越小，非酶蛋白就越多。值得注意的是，純度并不表示酶活性，如當酶變性后，RZ值仍可不變。
HRP的催化反應需要底物過氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無色的還原型染料，通過反應可生成有色的氧化型染料(D)。酶促反應的過程如下:
HRP2 ~2 y( w9 E+ M
DH2+H2O2────→D+2H2O
供氫體的種類很多，形成的產物特點不一。如DAB(3.3-二氨基聯苯胺)的反應產物為不溶性沉淀物，并有電子密度，故適宜于做免疫酶染色或電鏡觀察。S(5-氨基水楊酸)早期曾用于ELISA，但其溶解度不夠大，且空白孔不易控制到無色，現已很少應用。OT(鄰聯甲苯胺)的特點是能產生鮮艷的藍綠色產物且靈敏度較高，但反應中受溫度影響較大，而且由于產物不穩定，需要在短時間內進行測定。目前用得較廣泛和較滿意的供氫體是：OPD(鄰苯二胺)和TMB(四甲基聯苯胺)。前者形成的產物為深桔黃色或棕色，后者產物為藍綠色，二者的可溶性均好，在避光處顏色穩定，空白可近于無色，靈敏度上據報道后者比前者可高4倍以上。另外，還有一種供氫體稱ABTS[2, 2-邊氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)]，其反應產物呈藍綠色，且靈敏度和穩定性均好。尤其是在致癌的潛在可能性方面，ABTS與TMB皆是值得被優選的供氫體。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制劑，因此酶促反應中使用的H2O2不能過量。應控制在經較短時間反應后呈色即達高峰(說明H2O2已消耗殆盡)。這樣即使再延長時間也不會增加反應產物的顏色。
酶與抗體交聯的方法有許多種,根據酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結合物，可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。常用過碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結合。后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。
2.實驗步驟
HRP的制備
1).水提?。悍Q取5kg用水沖刷干凈的鮮辣根(辣根皮中亦含有豐富的HRP)，用菜刀切成小碎塊，在絞肉機中絞碎1～2次。次日用甩干機(或離心機)甩干，收集濾液，碎渣再用1/4倍體積水浸泡提取1次，合并2次濾液，測得總體積。
2).硫酸銨分級分離：在不斷攪拌下，每1000mL濾液中慢慢加入226g硫酸銨粉末(相當于0.40飽和度，0℃)，大約在1~2h內加完。次日將上清液小心地用虹吸管移出，下面混濁液以3 000r/min離心15min，棄沉淀，合并上清液。再按每1000mL上清液加258g硫酸銨粉末(0.8飽和度)隨加隨攪拌，當硫酸銨全部溶解后。次日，虹吸出上清液，沉淀部分在冰凍離心機中以13000r/min離心20min，棄去上清液，收集沉淀。將沉淀懸浮于100~150mL蒸餾水中(加水量要使沉淀全部溶解為止)，分裝于透析袋內，放在流動自來水中進行透析1～2天，直到硫酸銨透析完畢為止(可用5%乙酸鋇溶液或奈氏試劑進行檢查)。然后改換成用蒸餾水透析，中間更換2~3次，用0.1mol/L硝酸銀溶液檢查透析外液無氯離子為止。將透析液合并，在冰凍離心機中以4 000r/min離心15min，棄去沉淀，量上清液的體積。
3).丙酮分級分離：將上清液倒入燒杯并置冰鹽浴中，在不斷攪拌下，用細滴管沿杯壁加入1倍體積預冷至-15℃的丙酮，放置片刻，在冰凍離心機中以4000r/min離心15min，棄去沉淀。上清液再加入0.8體積(按原上清液體積)-15℃丙酮，(操作同上)，靜置后，在冰凍離心機中離心收集沉淀。將沉淀溶于少量蒸餾水中，透析除去丙酮。可得RZ值近于1的酶溶液。
4).精制：將上步酶液適當稀釋，滴加1mol/L硫酸鋅溶液，使酶液中鋅離子濃度為10 -3 mol/L，5 000r/min離心10min，得上清液。再將沉淀用少量蒸餾水洗滌，離心，洗液與清液合并，分裝于透析袋內，用水透析除鹽，用微孔濾膜過濾，進行真空冰凍干燥(約得20mg)，產品呈米黃色纖維狀松軟物，HRP產品的RZ值可達3.0左右，置真空干燥器中低溫保存。
(1)戊二醛二步法)
1) 原理：戊二醛為一種雙功能試劑，通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合，形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。
2)標記步驟：
(1) 稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中。
(2) 反應后的酶溶液經Sephadex G-25層析柱，用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘，收集棕色流出液。如體積大于5ml，則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中，緩慢攪拌。
(3) 將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml，攪拌下逐滴加入酶溶液中。
(4) 用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml，繼續攪拌3?小時。)
(5) 加0.2M賴氨酸0.25ml，混勻后，置室溫2小時。
(6) 在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨，置4℃1小時。
(7) 3000rpm離心半小時，棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次，zui后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。
(8) 將上述溶液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析，去除銨離子后(用萘氏試劑檢測)，10,000rpm離心30分鐘去除沉淀，上清液即為酶結合物，分裝后，冰凍保存。
3)結果判定：
(1) 定性及效價滴定：用特異性抗原(或抗體)同酶標記抗體(或抗免疫球蛋白抗體)作雙向瓊脂擴散試驗或免疫電泳試驗。然后用酶的底物使沉淀弧顯色，可初步鑒定其活性。zui后以直接ELISA法(或在正式實驗系統里)對酶結合物進行滴定( 見本節 (三)工作濃度的選擇)。
(2) 定量和克分子比值測定：可用分光光度計測定(光程1cm)。
酶量(mg/ml)=OD403nm×0.48
IgG量(mg/ml)=OD280nm-OD403nm×0.42)×0.94×0.62& I3 X) m+ {) X- E$ M
酶量(mg/ml) IgG量(mg/ml) 酶量
克分子比值=──────── ÷ ─────── = ─── × 49
40,000 160,000 IgG量
(3) 本法標記步驟比較簡單，重復性好。缺點是酶的利用率低，一般只有2~4%的酶與蛋白質結合。
4)試劑及器材：
(1) 0.1M PH6.8磷酸緩沖鹽水(PBS)：取0.2M Na2HPO4 49ml, 0.2M NaH2PO4 51ml，NaCl1.8克，加蒸餾水至200ml。
(2) 1.25%戊二醛液：取25%戊二醛50ml與PH6.8的PBS1ml混合。
(3) 1M PH9.5碳酸鹽緩沖液：取1M碳酸鈉3ml與1M碳酸氫鈉7ml混合。
(4) 0.2M賴氨酸溶液：稱賴氨酸29.2mg溶于0.01M PH9.5碳酸緩沖液1ml中。
(5) 0.15M PH7.4 PBS及生理鹽水。
(6) PH7.8飽和硫酸銨溶液及半飽和硫酸銨溶液。
(7) 萘氏試劑及聚乙二醇(PEG，MW2000)。
(8) 純化的特異性抗體或抗Ig抗體。
(9) HRP(RZ>3.0)。
(10) Sephadex G-25層析柱(2cm×50cm)。
(11) 攪拌器，分光光度計，離心機。
(12) 透析袋，大、小燒杯，試管，吸管等。
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(2)簡易過碘酸鈉法% E0 O+ v: s2 T
本法是以NaIO4先將HRP表面的糖分子氧化成醛基，然后再與Ig上的氨基相結合，所獲酶標記抗體的產率高，將近70%的HRP和Ig結合，99%的Ig與酶結合，酶與Ig的活性無重大損失，是目前zui常用的方法。
1)原理：
經典的過碘酸鈉法中需采用二硝基氟苯封閉HRP上殘留的α-和ε氨基基以避免酶分子之間的交聯。后來Wilson等改用在低PH下使NaIO4氧化HRP，從而省去了二硝基氟苯封閉HRP步驟。HRP經NaIO4氧化后形成的醛化酶可與抗體分子的氨基相連，形成斯夫氏鹼，后者可進一步用NaBH4(或乙醇胺)還原生成穩定的酶標記抗體。
8 n% @9 _& U8 s6 V2)標記步驟:
(1) 稱取5mgHRP溶解于1ml蒸餾水中。
(2) 于上液中加入0.2ml新配的0.1M NaIO4溶液，室溫下避光攪拌20分鐘。
(3) 將上述溶液裝入透析袋中，對1mM PH4.4的醋酸鈉緩沖液透析。
(4) 加20μl 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液，使以上醛化桯RP的PH升高到9.0~9.5，然后立即加入10mg IgG(抗體，或SPA5mg)在1ml 0.01M碳酸鹽緩沖液中，室溫避光輕輕攪拌2小時。
(5) 加0.1ml新配的4mg/ml NaBH4液，混勻，再置4℃2小時。
(6) 將上述液裝入透析袋中，對0.15M PH7.4 PBS透析。
其余步驟(純化)同戊二醛標記步驟的(6)、(7)、(8)。
3)結果判定：
除標記物IgG量的計算，略有不同以外，其余均同戊二醛法。
IgG量(mg/ml)=(OD280nm-OD403nm×0.3)×0.62
4)試劑及器材:
(1) 0.1M NaIO4：稱取241mg高碘酸鈉(廣州化學試劑廠，批號830602)溶于蒸餾水10ml中。
(2) 1mM PH4.4醋酸鈉緩沖液
0.2M NaAc (1.361克/50ml) 3.7ml
0.2M HAc (0.601ml/50ml) 6.3ml
加蒸餾水至2,000ml。
(3) 0.2M PH9.5碳酸鹽緩沖液:3 ?! $ z* p7 ]" g& X. E) z( f
Na2CO3 0.32克; s3 C. i! A5 q1 G/ w4 {
NaHCO3 0.586克: H% E M! O w- M
加蒸餾水至50ml
再用蒸餾水作20倍稀釋，即成0.01M PH9.5的碳酸鹽緩沖液。
(4) NaBH4溶液(4mg/ml):
臨用時稱取NaBH44mg溶于1ml蒸餾水中。
(5) 其它的試劑及器材可參見戊二醛標記法。
3.工作濃度的選擇
在免疫酶技術中，首先要確定的變異因素就是酶標記物的工作濃度。因為酶標記物濃度的很小變化，便可導致試驗結果產生很大的波動。另外，由于濃度過高，可使非特異性反應增加，而濃度過低又可影響測定的敏感性。因此，正式試驗前必須準確滴定其工作濃度。
酶標記抗體的滴定方法是：將抗原(或抗體)物理吸附于固相載體上，然后將經過一系列稀釋的酶標抗體(或抗Ig抗體)與吸附在載體上的抗原(或抗體)起反應，以酶與底物的顯色反應程度來確定酶標記抗體的效價，或稱工作濃度。
其步驟為：先將抗原(或抗體)用0.05M PH9.6包被緩沖液稀釋為10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔內加0.1ml，次日以洗滌緩沖液洗滌3次。酶標記抗體用1%BSA-PBS液依次稀釋成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根據據抗體的滴度而定)，分別加入反應孔中，每個稀釋度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小時后洗滌。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分鐘。以2M H2SO4 0.05ml終止反應。
結果判定主要以ELISA比色儀讀取各孔OD值。并以OD為縱座標，結合物濃度為橫座標，繪制滴定曲線。由曲線上查得OD值為1.0左右，且曲線斜率zui大時的酶標抗體稀釋度，即為該標記物的工作濃度。
有關試驗的試劑及器材均見ELISA部分。
C要說明的是，本法為ELISA直接法，所測的工作濃度與在實際應用中的zui適濃度可相差幾個滴度。這就要求在建立ELISA實驗系統中，因此基礎上還應進一步確定實際工作濃度(可采用方陣法)，以達到zui適的實驗條件。
4.注意事項
1. 在具備高質量HRP的條件下，所要標記的抗體也要活性高,效價高(zui低1∶16),純度高，親和力好，這是保證標記物效價高，免疫活性好的首要條件。"
2. 所使用試劑的PH和濃度及用量必須嚴格掌握。所用試劑，(或必需)新鮮配制。如在戊二醛標記法中所用戊二醛應為新鮮純品，因戊二醛儲存過久可形成縮和體(雜質)。否則，影響標記效果。
3. 室溫攪拌時須避光，室內溫度一般在25℃為宜。標記物每次透析前，須認真檢查，防止漏液。
4. 濃的標記物相當穩定，常加入30～40%甘油于-10℃下保存。4℃可保存1～2年，但稀釋成1∶10，只能保存數周。已配制的使用液應在12小時內用完。切忌反復凍融。
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